在深度烧伤创面上培殖表皮干细胞的研究
前言：
目前，科学家们在干细胞的研究上不断的获得成绩，总结世界的研究报道，其干细胞研究方法有三大类，其一类是胚胎或成体干细胞体外组织培植移植技术研究系统；其二类是体外胚胎或成体干细胞的单细胞培植移植技术研究体系；其三是体内干细胞原位组织培植技术研究体系。前两者的医学目标是通过移植体外培植的干细胞或组织器官，达到治疗器官组织损伤性疾病的目的；后者是作者发明建立的技术研究体系，医学目标是通过激活和调动器官组织原位局部的干细胞潜能，原位再生组织和器官，直接再生修复和修补损伤的组织器官，达到治疗器官组织损伤的目的。本报告专题介绍在深度烧伤创面上如何原位培植表皮角蛋白19型干细胞的技术程序情况。敬供大家参考。
什么叫原位干细胞培植？
原位干细胞是指：体内组织器官局部存在的干细胞和具有干细胞潜能的特殊组织细胞。其特点是存在于成体器官组织中，可转化为更原始和增殖能力的细胞；可直接在器官组织中再生为具有与原组织相同功能和结构的器官组织；其组织与原有器官组织再生为一体。实现这一原位组织修复技术的技术称原位干细胞培植技术。
材料与方法：
1、 深度烧伤创面：A、干细胞标记实验创面：下肢深度烧伤；B、临床重复创面：面部深度烧伤。
2、 干细胞标记实验方法：选角蛋白19型表皮干细胞作为特异阳性干细胞。实验方法是用小鼠单克隆抗体放射性免疫荧光技术。
3、 临床床技术：无损伤液化排除坏死皮肤技术和创面活组织培养技术(MEBT)。
4、 细胞培植物质，创面全营养培养基(MEBO-2)。
角蛋白19型表皮干细胞跟踪：
方法：在皮肤深度即时烧伤(伤后2小时内)，立即取创面深部活组织，和创面周围未烧伤区皮肤活组织，低温冰冻储存；待进行放免组织细胞的角蛋白19型表皮干细胞检查。而后立即行MEBT和MEBO-2治疗。分别在第24小时、第四天、第七天、第十四天、第十七天、第二十一天、第二十八天，取创面下的活组织，方法同上，检查其角蛋白19型阳性的细胞。
放免检查及结果：
伤后立即取组织进行组织学检查，确定为全厚皮烧伤(年龄大于25岁)才能入选，同时立即取伤区活组织和未伤皮肤组织进行放免检查，未查见角蛋白阳性的19型表皮干细胞；伤后24小时则查见19型表皮干细胞；第7天开始向高峰发展，第十四天达高峰；而后逐渐减少，到第二十八天，降到最低点；创面第二十八天基本愈合，真皮、表皮修复。(见图)
面部深度烧伤重复实验：
1、 面部烧伤半小时(年龄58岁)，立即取创面活组织检查为全厚皮坏死；(图)
2、 立即行MEBT疗法，将皮肤耕耘至深部活组织，外涂MEBO-2，使MEBO-2 直接渗入到创面下活组织。(图)
3、 无损伤液化排除坏死皮肤层。(图)
4、 继续培养创面活组织，创面下活组织组织学显示呈皮肤干细胞增殖生长状态。(图)
5、 继续培植创面，见与创面基底生理连接的正常结构皮肤从创面中透出。(图)
6、 继续培植50天，面部正常结构的皮肤原位完全再生。(图)，原位干细胞原位复制皮肤完成。
临床扩大实验：
原位培植皮肤技术治疗烧伤，在全身系统外科治疗的配合下，已成为重要可靠的大面积烧伤治疗技术。现展示大面积烧伤治疗所获的再生新皮肤的实体状态。(图)
讨论：
原位表皮干细胞研究实验论证说明
1、角蛋白19型表皮干细胞：多种研究一致认为，人的皮肤中的表皮基底细胞、毛囊、腺体中均存在表皮干细胞，有的接近成体细胞，有的仍具有较原始的分化能力，如毛囊中的干细胞。从而人们把这些干细胞按其原始分化能力和角蛋白的表达类型，分多种类型。公认的事实，在正常皮肤中，存有小于角蛋白16型的表皮干细胞。而本课题选定的角蛋白19型表皮干细胞，是皮肤器官组织胚胎形成中的表皮干细胞，在皮肤形成成体器官后，表皮干细胞不再表达为19型。所以，本课题选角蛋白19型作为表达检查干细胞具有特异性，以区分其他表皮干细胞。排除其他表皮干细胞的干扰。本实验证明，用同样的方法检查未烧伤区皮肤组织，未查见角蛋白19型表皮干细胞。以此说明实验设计的可靠性。
2、活检组织处理方法，由于本实验为原位干细胞实验，不能用细胞传代的方法进行细胞检查鉴定，因细胞传代则无法证明原位细胞的特性，也就是说，对传代细胞的鉴定不能代表原位细胞的鉴定，两者有质的区别。本实验采取对活检组织立即冰冻、阻止细胞传代的方法，有其特异的准确性；细胞标本真实；活检组织的表达与原位细胞一致。
原位培植方法说明
本实验采取的是一种在烧伤后直接在活组织原位培植表皮干细胞的方法，实现其方法有三个关键环节，其一、设法尽快在烧伤后将干细胞培养基送到原位；其二、是如何尽快无损伤清除影响表皮干细胞再生的坏死皮肤；其三、如何在创面上原位培植干细胞再生皮肤。这三大技术是培植原位干细胞的关键，也是外科医生的技术实施水平体现。由于这些技术是专项的临床应用操作技术，将在另一专题中分别介绍。
MEBO-2的说明
MEBO-2是专门用于培养皮肤的产品，全由营养物质组成，具有激活和诱导具有干细胞潜能的细胞增殖的作用，具有调节表皮干细胞和成纤维细胞再生增殖的作用；具有创造创面生理微环境的作用；具有营养保护创面的作用；他是一种由多种天然成分组成的组合物。目前仍在商业秘密阶段。
角蛋白19型表皮干细胞表达规律
从本实验结果表明，全厚皮肤烧伤坏死后，残存于皮下组织中的具有表皮干细胞潜能的某些组织细胞，可被激活和诱导成角蛋白19型表皮干细胞，而新出现的角蛋白19型干细胞在创面愈合过程中增殖活跃，在创面修复的高峰期，其量也达高峰；而在愈合后期，其量逐渐减少，很可能是19型表皮干细胞已向成体型细胞转化，形成组织所至。在组织切片检查中证实了这一规律。关于角蛋白19型干细胞被激活和被诱导的机制及基因表达研究，也将另行报道。
原位表皮干细胞培植技术的科学价值和评价
人体皮肤是最大、功能最多、含器官组织最的多的器官，原位角蛋白19型表皮干细胞的培植成功，不仅给深度烧伤的治疗提供了保守治疗的新方法，而且给人体原位组织器官的原位干细胞再生技术创出了一条新路。但是本实验仅报道了表皮干细胞的培植情况，而皮肤器官中的多种细胞组织的培植情况尚待继续报道和研究。