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尊龙凯时胃肠胶囊维持胚胎小白鼠小肠组织植块存活及重新组合成粘膜组织

尊龙凯时集团中心实验室 徐荣祥,王运平,范然,王建虹,林海
 

[摘 要]:目的:通过体外检测尊龙凯时胃肠胶囊(GIC)对胚胎小白鼠小肠器官型植块生长的作用以探索GIC修复粘膜损伤的机理。方法:体外培养胚胎小白鼠小肠器官型植块,并将所有植块分为两组:实验组和对照组。结果:实验组的小肠器官型植块能很好地维持存活,并有大量的单个细胞、细胞克隆以及片状粘膜组织块长出,生长的时间长,生长状态好;而对照组的小肠器官型植块均很快归于死亡。二者差异极为显著。结论:GIC能够维持胚胎小白鼠小肠器官型植块的存活,并能促进细胞增殖,某种程度上维持组织的完整性,重新组合成粘膜组织,此结果可能与GIC激活上皮干细胞有关。

[关键词]:GIC;小肠植块;生长

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]: Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]: GIC; intestinal explant ; growth

  大量临床实践显示,GIC可能也是通过激活粘膜上皮干细胞、促进组织细胞生长的机理实现对损伤粘膜修复的,为了证明这一观点,我们特设计了本实验。

  一. 仪器、设备、材料、试剂及实验动物

  培养箱(美国Forma)、冰箱(江苏长岭)、倒置显微镜(重庆光学仪器厂)、超级恒温水浴及恒温电烤箱(重庆四达)、超净工作台(北京半导体设备二厂)、显微成像分析系统(上海科瑞)、微波炉(广东Galanz)、微型计算机(北京沐泽)、光学显微镜(江苏光学仪器厂)、各种型号注射器、12孔培养板(丹麦NUNC)、50ml离心管、Eppendorf离心管、微量加样器(1000μl、200μl、20μl、10μl, 均为法国Gilson)、大小滴头、玻璃培养皿(φ5cm、φ6cm)、0.22μm微孔滤膜、针头滤器、显微外科器械、各种眼科手术器械、有盖三角烧瓶、有盖小试管、针头、GIC(尊龙凯时公司生产)、MEM培养基(美国Hyclone)、胎牛血清(杭州三利)、青霉素和链霉素(华北制药)等。

  实验动物:昆明种胚胎小白鼠

  二. 实验方法:

  1.取孕16日龄的昆明雌性小白鼠,颈椎脱臼法处死之,先置于75%乙醇中粗洗一遍(2分钟),再置于75%乙醇中消毒5分钟;

  2.用眼科剪以及止血钳先剪开雌鼠的腹部皮肤,钝性分离至两侧,充分暴露腹壁肌肉,然后小心剪开腹壁全层,切勿伤及内脏及小鼠胚胎;

  3.剪开子宫,从宫腔中取出胚胎鼠,置入无菌平皿中;

  4.用双抗-冷PBS将胚胎鼠体表洗涤两次,每次1分钟;

  5.用显微外科剪刀将胚胎鼠的腹壁剪开,再用显微外科镊子夹起鼠近胃端小肠(包括十二指肠和空肠),截取2cm左右;

  6.用双抗-冷PBS将胚胎鼠小肠连续洗涤两次,每次1分钟;

  7.用显微外科剪刀将肠管纵行切开,充分暴露粘膜面;

  8.用双抗-冷PBS将胚胎鼠小肠连续洗涤两次,每次1分钟;

  9.将鼠小肠置于含双抗(青、链)的MEM培养液中冲洗2次,每次1分钟;

  10.将鼠小肠剪成极小的器官型植块,大小约1mm×1mm;

  11.将植块置于12孔培养板的培养孔中央,每孔5块,间隔约2mm,布局合理,粘膜面向上,轻轻按压每块植块,使其紧贴培养板的表面;

  12.沿着培养孔的边缘,每孔中加入约0.5ml的完全MEM培养液,勿使培养液与植块接触;

  13.将培养板置于37,5%培养箱中预孵育1.5小时;

  14.每孔加完全MEM培养液2ml,轻拿轻放,切勿使植块飘起,实验组加GIC;

  15.实验组和对照组同步等量换液,每次去掉原液的1/2左右, 再加入相同量的新鲜MEM培养液;

  16.用倒置显微镜观察植块生长情况,用显微成像记录分析系统记录所观察的结果,并用计算机保存图像。

  三.实验结果

  细胞培养110天内的报告结果:实验组和对照组的肠组织植块在培养之初,均能固定在培养孔中央,但随着培养时间的推移,植块逐渐脱离培养孔底部平面,游离飘浮于深层培养液中,悬浮的位置仍然靠近培养孔底部,但仍然集中于培养孔中央,少数位于周边,植块的大小和形状几乎没有变化,但在培养的第10天左右,组织块就开始变得膨松,然后逐渐裂解为很小的组织块,并最终成为肉眼不易察觉的组织块,这时在视野中发现了单个细胞以及细胞克隆。在培养的第20天,对照组中的细胞以及细胞克隆逐渐死亡,而实验组细胞依旧生长良好,单个细胞越来越多,在视野中到处可见,以位于中央部位的最多,细胞圆形,细胞核清晰。细胞呈典型活细胞状态。越向外越少,边缘几乎没有,细胞克隆数也逐渐增多。每个克隆所含有的细胞个数随着时间的推移也越来越多。上述结果说明含15%胎牛血清的MEM培养基无法提供给组织块合适而充足的营养,而GIC作为高级细胞培养基能够提供给细胞合理而充足的营养,保证了组织和细胞的活性。

  下面为培养过程中,实验组和对照组的对比图谱,可以深刻反映两组的差别。

图1 培养第24天。图1A为对照组,图1B为实验组。对照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经死亡,实验组中显示的是大量单个的小肠组织细胞,但其中没有克隆。
图1A
图1B
图2 培养第30天。图2A为对照组,图2B为实验组。对照组中为位于视野中央的大量小肠组织细胞或细胞克隆已经死亡,实验组中显示的是即将形成克隆的细胞。
图2A
图2B
图3 培养第38天。图3A为对照组,图3B为实验组。对照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经死亡,实验组中显示的是一块较为完整的小肠粘膜组织。

图3A
图3B
图4 培养第42天。图4A为对照组,图4B为实验组。对照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经死亡,实验组中显示的是一块小肠粘膜组织。

图4A
图4B

 
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